O que é VHS (Velocidade de Hemossedimentação)

O que é VHS?

VHS?

A velocidade de hemossedimentação (VHS) mede o grau de sedimentação de glóbulos vermelhos em uma amostra de sangue durante um período específico. O VHS é um teste muito sensível, porém não específico, que é freqüentemente o primeiro indicador de doença quando outros sinais químicos e físicos estão normais. O VHS comumente aumenta significativamente em doenças inflamatórias disseminadas: as elevações podem ser prolongadas em inflamação localizada e câncer.

Objetivo

•Monitorar doença inflamatória ou maligna.

•Auxiliar na determinação e diagnóstico de doenças ocultas tais como tuberculose, necrose tecidual ou doença do tecido conectivo.

Preparo do paciente

Jejum de 4 horas.

Valores de referência

Método: Westergreen, sistema automatizado

O VHS normal varia de 0 a 10 mm/hora em homens e de 0 a 15 mm/hora em mulheres.

Achados anormais

O VHS aumenta na gravidez, anemia, inflamação aguda ou crônica, tuberculose, paraproteinemias (especialmente mieloma múltiplo e macroglobulinemia de Waldeströn), febre reumática, artrite reumatóide e algumas malignidades.

A policitemia, anemia falciforme, hiperviscosidade e baixos níveis de fibrinogênio plasmático ou de globulina, tendem a deprimir o VHS.

Exames corretados

PCR, ASLO, alfa1-glicoproteína ácida, hemograma

DICA DE LEITURA – A Janela de Euclides

Methron Livros

Leonard Mlodinow, PhD em física e matemática, é um cientista fora do convencional. Como imaginar que um físico especializado em educação para crianças e adolescentes e fascinado com números pudesse ser também um roteirista para filmes de entretenimento, como a série “Jornada nas Estrelas”?

Pois foi exatamente por causa disso, e da extrema clareza com que escreveu seu primeiro livro, A Janela de Euclides, que Mlodinow foi escolhido para ajudar a ninguém menos que Stephen Hawking a escrever a seqüência do mega-sucesso Uma Breve História do Tempo – o que ele está fazendo agora, para publicação em 2005.

A curiosidade é uma das principais características dos cientistas – e curioso Mlodinow foi sempre, desde criança. Cursava ainda a 5ª série do ensino fundamental quando, ao fazer experiências com foguetes, explodiu a garagem de sua casa e só não perdeu a visão porque, prudente, usava óculos de segurança. Mas passou um bom tempo com os dois braços enfaixados.

A experiência foi dolorida, mas não o suficiente para limitar seu interesse pela ciência. Foi também na 5ª série que Mlodinow descobriu o universo fascinante da geometria e sua beleza. Desde então, debruçou-se com entusiasmo sobre este tema. Seu primeiro livro, lançado agora pela Geração Editorial (A |Janela de Euclides, 296 páginas, R$ 39,50), narra a história da geometria de forma clara e elucidativa, contrariando a idéia de que a matemática é um assunto pesado e para especialistas.

Como todas as pessoas curiosas, Mlodinow não se limitou a uma única área de interesse. Na Universidade da Califórnia, em Berkeley, quando ainda era aluno na pós-graduação, fez um roteiro que abriu para seu talento as portas de Hollywood. Até hoje ele é chamado com freqüência para escrever roteiros científicos ou trabalhar como consultor em filmes de ciência ou ficção científica. Costuma fazer palestras e já desenvolveu CD-ROMs educativos que foram campeões de venda e receberam inúmeros prêmios.

A geometria, pelas suas mãos, perde todo o ranço das matérias insondáveis. Esta ciência, afinal, permeia todo o mundo em que vivemos. Ela afeta as nossas percepções de arte e música. A pintura e a escultura seguem princípios geométricos básicos de proporção e simetria; as relações definem as escalas musicais e as composições clássicas são altamente matemáticas em sua natureza. A arquitetura busca na geometria as bases do que é possível construir. Até o corpo humano tem uma elegância geométrica em si: o famoso desenho de Leonardo da Vinci de um homem em pé dentro de um círculo é uma demonstração de com nossa fisiologia se harmoniza com a natureza e suas leis.

Beleza pura

Essa beleza, e a emoção de percebê-la em tudo o que há no universo, perpassa todo o livro de Mlodinow, que pode ser compreendido por crianças – ser entendido pelas crianças sempre foi o objetivo do escritor –, adolescentes e adultos. A Janela de Euclides elimina a idéia de que cientistas são seres frios e sem emoções. Percebemos com este livro o quanto as histórias do desenvolvimento das idéias e da civilização podem encantar, dependendo de como são contadas.

– Acredito que a história de quase tudo desenvolvido pela matemática e pela ciência pode ser escrito de maneira interessante porque, tendo-a vivido, eu sei que a criação do progresso científico é um processo muito emocionante com personagens interessantes, bastante altos e baixos, e de situações dramáticas – afirma o autor.

O manifesto da revolução original da geometria foi escrito por um homem misterioso chamado Euclides. Com seu livro, Os Elementos, Euclides abriu uma janela através da qual a natureza de nosso universo tem sido revelada. Depois dele, outras quatro revoluções transformaram a geometria. Mlodinow descreve quais foram estas revoluções, os profetas e as histórias atrás de cada uma delas: desde Euclides, na Antiguidade, até à teoria das cordas e do hiper-espaço.

Mlodinow vai descortinando as sucessivas descobertas da humanidade, desde o momento em que alguém começou a medir um terreno para cobrar impostos, ou o próprio país, para definir suas fronteiras, até que a humanidade se descobriu medindo a terra e o universo.

Primeiro, um grego, Pitágoras, descobriu as linhas paralelas e montou seu modesto sistema de regras abstratas que podiam modelar o mundo. A humanidade haveria de perder algum tempo na Idade Média, até que, na França do século XIV, um obscuro bispo católico inventou o gráfico e juntou linhas e números. Enquanto marinheiros intrépidos viajavam de um lado para o outro no oceano Atlântico indo ao Novo Mundo, um gênio de 15 anos de idade chegou à conclusão de que, assim como a superfície da Terra, o espaço também poderia ser curvo. As linhas paralelas poderiam realmente se encontrar? Os ângulos de um triângulo poderiam totalizar – mais ou menos – 180 graus? A revolução do espaço curvo reinventou tanto a Matemática quanto a Física; isto também preparou o cenário para um funcionário de um escritório de patentes chamado Einstein adicionar o tempo às dimensões do espaço. Sua grande revolução geométrica anunciou a era moderna da Física.

Vivemos em meio a uma revolução científica. Por todo o mundo, cientistas estão reconhecendo que todas as forças maravilhosas e variadas da Natureza podem ser entendidas através da geometria – uma nova geometria bem estranha. É uma matemática excitante de dimensões extras e retorcidas, nas quais o espaço e o tempo, a matéria e a energia se entrelaçam e se revelam como conseqüências de uma estrutura profunda subjacente do universo.

O livro de Mlodinow está recheado de uma grande pesquisa histórica. Mas Mlodinow também trouxe sua experiência e estudo com amigos cientistas de extrema importância para a ciência atualmente: Richard Feynmann, Stephen Hawking e Kip Thorne. Além deles, Leonard Mlodinow também se valeu de entrevistas com físicos e matemáticos aclamados em nossa época: Murray Gell-Mann, Edward Witten e Brian Greene.

O que mais fascina no livro, além dessa enorme quantidade de conhecimento em poucas páginas, é a facilidade com que se lê e se compreende tudo. Leonard Mlodinow consegue como poucos o milagre de contar uma história complexa de forma tão agradável, engraçada e fascinante que, depois de ler seu livro, nenhum espaço, nenhuma coisa e nenhum tempo será novamente igual como era antes.

Desenvolvimento da Reação em Cadeia da Polymerase (PCR)

Methron Informativo PCR o que é.

O que é PCR? Saíba mais….

Introdução a PCR – reacção em cadeia do Polymerase

Mais de 30 anos há, a introdução de tecnologia de ADN de recombinação como uma ferramenta para as ciências biológicas revolucionou o estudo da vida.  O clonagem molecular permitiu o estudo de genes individuais de organismos vivos; entretanto esta técnica era dependente de obter uma quantidade relativamente grande de ADN puro.  Isto dependeu da réplica do ADN dos plasmídeo ou dos outros vetores durante a divisão de pilha dos micro-organismos (1).  Os investigadores encontraram-no extremamente laborioso e difícil obter um ADN específico na quantidade da massa dos genes atuais em uma amostra biológica (2).   A tecnologia de ADN de recombinação fêz possível a primeira análise molecular e o diagnóstico pré-natal de diversas doenças humanas.  O ADN Fetal obtido pela amostragem da amniocentese poderia ser analisado pela digestão da enzima da limitação, pela electroforese, por transferência do sul e pela hibridação a um gene clonado ou às pontas de prova do oligonucleotide (3).  Entretanto, a mancha do sul permitiu somente o traço rudimentarmente dos genes nos indivíduos não relacionados (4).
Reacção em cadeia do Polymerase (PCR)

O PCR, um acrônimo para a reacção em cadeia do Polymerase (5.6), permitiu a produção de grandes quantidades de um ADN específico de um molde complexo do ADN em uma reação enzymatic simples.  O PCR é um procedimento in vitro recentemente desenvolvido para a amplificação do ADN.  O PCR transformou a maneira que quase tudo estuda a exigência da manipulação de fragmentos do ADN pode ser executado como resultados de suas simplicidade e utilidade (7).

Nos anos 80, em Kary Mullis (figura 1) e em uma equipe dos investigadores em Cetus Corporaçõ em Cetus Corporaçõ concebido de uma maneira de começar e parar a ação de um polymerase em pontos específicos ao longo de uma única costa do ADN.  Mullis igualmente realizou que aproveitarando este componente da tecnologia molecular da reprodução, o ADN do alvo poderia exponencial ser amplificado.  Este procedimento da amplificação do ADN foi baseado no in vitro um pouco do que in vivo um processo (5.6.8).  A amplificação sem célula do ADN pelo PCR podia simplificar muitos dos procedimentos padrão para o clonagem, analisando, e de ácidos nucleicos de alteração (1).  As técnicas precedentes para isolar uma parte específica de ADN confiaram no clonagem de gene – um procedimento fastidioso e lento.  O PCR, de um lado Kerry Mullis indic “deixa-o escolher a parte de ADN que você está interessado dentro e ter tanto quanto dele enquanto você quer” (2.8).   Quando outros cientistas de Cetus sucedidos eventualmente em fazer a reacção em cadeia do polymerase executam como desejado em uma forma de confiança, tiveram uma técnica imensa poderosa para fornecer essencialmente quantidades ilimitadas dos biólogos moleculars precisos e de outro de material genético exigidos para seu trabalho (8).  Desde o primeiro relatório in1985, mais de 5000 papéis científicos foram publicados por 1992 (1).  Além disso, o grande número de publicações naturalmente faz impossível rever todas as contribuições importantes para o desenvolvimento e a aplicação da tecnologia do PCR; entretanto nós tentaremos rever aqui os desenvolvimentos os mais importantes na prática do PCR básico.
PCR, um conceito a ser descoberto

O PCR provavelmente foi concebido pelo Dr. Kerry Mullis em 1983 ao trabalhar no Cetus Corporaçõ em Emeryville, CA.  Entretanto, algum trabalho de abertura de caminhos foi feito igualmente por Gobind Khorana em 1971 quem descreveu um princípio básico de replicating uma parte de ADN usando duas primeiras demão.  O progresso foi limitado então pelas edições da purificação da síntese e do polymerase da primeira demão (9).   Na cabeça de Mullis, a invenção cresceu de um esquema teórico para executar arranjar em seqüência limitado do dideoxynucleotide de genes humanos originais usando oligonucleotides sintéticos com a finalidade de diagnosticar mutações humanas comuns da doença.  Um obstáculo óbvio a uma estratégia arranjando em seqüência tão direta era a complexidade elevada dos pares baixos humanos do genoma (3.3 x 109).  Assim, um segunda oligonucleotide ou primeira demão foram adicionados para obstruir a progressão da síntese da primeira primeira demão.   Mais tarde entretanto, esta segunda primeira demão foi incluída para ligar à outra costa do ADN, de modo que cada costa do alelo do mutante contribuísse ao sinal eventual.  Se o esquema que envolve a hibridação simultânea das primeiras demão a cada costa foi modificado aquecendo a mistura e então repetindo o recozimento e etapas da extensão, a seguir o sinal preliminar seria mesmo mais adicional aumentado.  Repetir as etapas permitiria os produtos do primeiro círculo de ser duplicada no segundo ciclo, para render duas cópias.  Repetir o ciclo outra vez conduziria a quatro cópias, etc.  Diversas semanas passaram antes que esta grande ideia estêve tentada (8).  Duas primeiras demão foram sintetizadas para ser perfeitamente complementares a cada fim da região baixa de 110 pares de um segmento clonado do gene humano da b-globina, a amplificação foi executada, e os produtos foram identificados pela electroforese do gel do acrilamido.  O resultado final era o fragmento baixo antecipado do ADN de 110 pares e o começo do PCR como uma técnica básica na biologia molecular (5.6).

No processo original do PCR de Mullis (5.6.8), a enzima foi usada in vitro (em um ambiente controlado fora de um organismo).  O ADN double-stranded foi separado em duas únicas costas aquecendo á 96°C.  Nesta temperatura, entretanto, o polymerase de ADN de Escherichia Coli foi destruído de modo que a enzima tivesse que ser reabastecida após o estágio do aquecimento de cada ciclo.  O processo original do PCR de Mullis era muito incapaz desde que exigiu muitas hora, quantidades vastas de ADN-Polymerase, e atenção contínua durante todo o processo do PCR.
Princípios gerais do PCR

A examinação do mecanismo da amplificação do PCR revela sua simplicidade mas igualmente sua elegância (figura 2).  As primeiras demão do Oligonucleotide são projetadas primeiramente ser complementares aos fins da seqüência a ser amplificada, e misturada então no excesso do molar com o molde do ADN e nos deoxyribonucleotides em um amortecedor apropriado.  Aquecimento de seguimento para desnaturar as costas do original e refrigerar para promover o recozimento da primeira demão, os oligonucleotides cada ligamento a uma costa diferente do fragmento do alvo.  As primeiras demão são posicionadas de modo que quando cada um é estendido pela ação de um polymerase de ADN, as costas recentemente sintetizadas sobrepor o local obrigatório do oligonucleotide oposto.  Enquanto o processo de desnaturação, de recozimento, e de extensão do polymerase é continuado as primeiras demão ligam repetidamente ao molde original do ADN e aos locais complementares nas costas recentemente sintetizadas e estão estendidas para produzir cópias novas de ADN (figura 3).  O resultado final é um aumento exponencial no número total de fragmentos do ADN que incluem as seqüências entre as primeiras demão do PCR, que são representadas finalmente em uma abundância teórica de 2n, onde n é o número dos ciclos (1.7.13).
Polymerases/especificidade e eficiência da reação

Um polymerase de ADN é uma enzima natural, uma macromolécula biológica que catalise a formação e o reparo do ADN. Trabalha ligando a uma única costa do ADN e criando uma costa complementar.  A réplica exata de toda a matéria viva depende desta atividade, onde funciona para duplicar o ADN quando as pilhas se dividem (10.11).  Somente tenha recentemente cientistas aprendidos manipular esta atividade e aplicá-la à investigação científica.  As experiências as mais adiantadas do PCR utlilized o fragmento de Klenow do polymerase de ADN de Escherichia Coli mim em uma temperatura de 37C para amplificar alvos específicos de ADN genomic humano (5.6).  Frequentemente estas reações do PCR produziram o produto incompleta puro do alvo como julg pela electroforese do gel (1).  Estas amplificações iniciais do PCR com o fragmento de Klenow não eram altamente específicas (5.6).  Embora um fragmento original do ADN poderia ser a dobra ~200.000 amplificada do ADN genomic, simplesmente aproximadamente 1% do produto do PCR era a seqüência alvejada (13).  Uma ponta de prova específica da hibridação foi exigida analisar o ADN amplificado (5.6).

Algumas condições do PCR foram determinadas aumentar a dureza da hibridação da primeira demão tal como umas mais baixas concentrações do MgCl2 e umas mais altas temperaturas do recozimento.

Além disso, a concentração de enzima e de primeiras demão, todos a época de recozimento, o tempo da extensão, e o número de PCR dão um ciclo foram encontrados para efetuar a especificidade do PCR.

Também, a concentração de uma seqüência específica em uma amostra pode igualmente influenciar a homogeneidade relativa dos produtos do PCR (1.7.13.14.15).   Os triphosphates e o magnésio de Deoxyribonucleotide em um amortecedor apropriado são igualmente ingredientes importantes para o PCR.  A eficiência e a especificidade de PCRs podem ser afetadas por variações na concentração e na relação do magnésio, de triphosphates do deoxyribonucleotide, e de primeiras demão livres.  Estes reagentes devem ser aperfeiçoados a fim conseguir a especificidade e o rendimento elevados (14).  Igualmente descobriu-se que o efeito da temperatura e do comprimento da primeira demão do oligonucleotide na especificidade e na eficiência da amplificação pela reacção em cadeia do polymerase (15).

A inactivação do fragmento de Klenow do polymerase de ADN de Escherichia Coli eu na alta temperatura exigida para a separação da costa exigi a adição de enzima após a etapa da desnaturação de cada ciclo (5.6).  Antes de 1988, qualquer um que conduz um procedimento da reação do PCR foi obrigado a sentar-se pacientemente por uma série de banhos da água ou de blocos de aquecimento e a adicionar uma parte alíquota fresca do polymerase de ADN de Escherichia Coli após cada etapa da desnaturação, que foi realizada tipicamente imergindo a embarcação da reação na água de ebulição para o ½ um o minuto a 3 minutos (7).   Esta etapa um pouco fastidiosa foi eliminada pela introdução de um polymerase de ADN thermostable, o polymerase de ADN de Taq (12) uma vez, no início da reação do PCR.  As propriedades thermostable da atividade do polymerase de ADN foram isoladas do aquaticus de Thermus (Taq) (figura 4) que que crescem nos geysers de 110C excedente, e contribuiu extremamente ao rendimento, à especificidade, à automatização, e à utilidade da reacção em cadeia do polymerase (1.7.12).   A enzima de Taq pode suportar o aquecimento repetido a 94C e assim cada vez que a mistura é refrigerada para permitir que as primeiras demão do oligonucleotide liguem o catalizador para a extensão está já atual (1.7).  Entretanto, umas mais altas temperaturas do recozimento não foram estabelecidas até o único “a maioria de desenvolvimento importante do desenvolvimento do PCR” (8), da purificação e da distribuição comercial de um polymerase de ADN resistente ao calor do aquaticusthermophilic de Thermus da bactéria (Taq) (12).

A isolação de um polymerase de ADN resistente ao calor igualmente permitiu o recozimento da primeira demão e a extensão a ser realizada nas temperaturas elevados (1.7.12.13), reduzindo-se desse modo combinou mal o recozimento às seqüências do nontarget (amplificação não específica) ou à especificidade crescente.   Desta maneira, porque muitas amplificações o produto do PCR poderia ser detectado como uma faixa brometo-manchada único ethidium em um gel electrophoretic (12).  Esta especificidade aumentada igualmente aumentou o rendimento do ADN da seqüência do alvo.  Além disso, uns produtos mais longos do PCR podiam ser amplificados do ADN genomic, provavelmente devido a uma redução na estrutura secundária das costas do molde na temperatura elevado usada para a extensão da primeira demão.  O limite superior do tamanho para a amplificação do polymerase do fragmento de Klenow era somente sobre 400bp.  O polymerase de Taq e outros polymerases thermostable sintetizaram o kb até 10 dos fragmentos (1.7.12.13).  A disponibilidade do polymerase de Taq igualmente simplificou extremamente a automatização da reação porque é uma tarefa muito mais fácil construir um instrumento que desse um ciclo um tubo da reação com as temperaturas diferentes do que para manufaturar um dispositivo que executasse thermocycling e a adição de partes alíquota da enzima.  Atualmente há uma grande variedade de thermocyclers disponíveis comercialmente.  Este desenvolvimento foi um fator significativo na aplicação rápida desta tecnologia pela comunidade científica (7).
Utilidade do PCR

Além do que a produção de fragmentos double-stranded, sem corte-terminados do ADN que podem ser dados forma pelo PCR, outras duas características do PCR planejam contribuem extremamente à utilidade do PCR.  Primeiramente, a posição do emperramento das primeiras demão define os limites do fragmento amplificado e conseqüentemente a exigência molecular prévia do clonagem de locais de reconhecimento do endonuclease da limitação não é exigida para o PCR.  Porque somente um número limitado de seqüências do ADN é locais da limitação, o PCR aumenta extremamente a flexibilidade da escolha do tamanho e da composição do fragmento.  Em segundo lugar, não é necessário que os oligonucleotides do PCR seja exatamente complementar ao ADN do molde.  As “caudas” podem ser adicionadas ‘ a extremidade aos 5 da primeira demão para introduzir seqüências dentro dos locais da escorva que assim podem ser explorados para introduzir locais de reconhecimento do endonuclease da limitação ou outras seqüências úteis tais como mutações no ADN amplificado.  Este os fenômenos permitiram a emergência do PCR como um método para o clonagem rápido do ADN (1.7.13).
PCR e clonagem molecular

O clonagem molecular tirou proveito da emergência do PCR como uma técnica.  O clonagem direto foi conduzido primeiramente usando um fragmento do ADN de 110 bp amplificado pelo PCR e as primeiras demão do oligonucleotide que contiveram locais de reconhecimento do endonuclease da limitação adicionaram a suas 5 ‘ extremidades.  Estes locais foram usados para facilitar o clonagem do ADN amplificado em um plasmídeo M13 (17).  O fragmento de 110 bp foi arranjado em seqüência igualmente para confirmar que esta aproximação era um rapid contudo aproximação de confiança ao clonagem.  (Figura 5)
Misincorporation: Erros in vitro de sistemas

O clonagem Cell-based do ADN envolve a réplica do ADN in vivo, que é associada com uma fidelidade muito elevada do copi por causa de corrigir mecanismos.  Entretanto, quando o ADN replicated in vitro como com PCR, a taxa de erro de copi é consideravelmente maior.  O polymerase o mais amplamente utilizado, polymerase de ADN de Taq entretanto, não tem nenhum exonuclease a 3 ‘ 5 ‘ associado a conferenciar uma função de correcção.  Assim a taxa de erro devido ao misincorporation baixo durante a réplica do ADN é um pouco elevada para Taq: para um 1 kb arranje em seqüência que se submeta a 20 ciclos eficazes da duplicação, aproximadamente 40% das costas novas do ADN sintetizado pelo PCR que usa esta enzima conterá um nucleotide incorreto resultando de um erro de copi (16).  Conseqüentemente, mesmo se a reação do PCR envolve a amplificação de uma única seqüência do ADN, o produto final será uma mistura quase da harmonização, mas seqüências nao idênticas do ADN.  Apesar dos erros devido à réplicain vitro, arranjar em seqüência do ADN do produto total do PCR pode dar a seqüência correta devido ao fato de que a incorporação de bases incorretas é essencialmente aleatória e a contribuição de uma base incorreta em umas ou várias costas está oprimida pelas contribuições da maioria enorme das costas que terão a seqüência correta.  Entretanto, se o produto do PCR deve ser clonado nas pilhas, diversos clone individuais podem precisar de ser arranjado em seqüência a fim determinar a seqüência correta (do consenso), antes das experiências mais adicionais de condução.

Mais recentemente, o problema da infidelidade da réplica do ADN durante a reação do PCR foi reduzido consideravelmente usando os polymerases de ADN heat-stable alternativos que associaram a atividade do exonuclease a 3 ‘ 5 ‘.  Os polymerases de ADN do furiosus de Pyrococcus (Pfu) e Thermococcus Litoralis (RESPIRADOURO) estão tornando-se mais amplamente utilizados por causa da correcção conferenciada por sua atividade associada do exonuclease a 3 ‘ 5 ‘ (18).  O produto resultante do PCR de Pfu por exemplo, tem muito nível inferior das mutações introduzidas copiando erros: para um 1 segmento do kb do ADN que se submeteu a 20 ciclos eficazes da duplicação, aproximadamente 3.5% do ADN encalham no produto carreg uma base alterada (16).
Especificidade da reação

As aproximações novas para melhorar a especificidade foram desenvolvidas basearam no reconhecimento que o polymerase de ADN de Taq retem a atividade enzymatic considerável em temperaturas bem abaixo da situação óptima para a síntese do ADN.  Assim, as primeiras demão que recozem não especìfica a uma região encalhada parcialmente única do molde podem ser prolongadas antes que a reação alcangue 72°C para a extensão de primeiras demão especificamente recozidas.  Se o polymerase de ADN é ativado somente depois que a reação alcangou altamente (>70°C) as temperaturas, amplificação do não-alvo podem ser minimizadas (19.20).  Esta “aproximação do começo quente” pode ser realizada pela adição manual de um reagente essencial ao tubo da seleção em temperaturas elevados.  A adição de proteína obrigatória do ssDNA foi relatada igualmente para aumentar a amplificação específica.  Mais usuário – a aproximação amigável é usar a inibição ou a inactivação do polymerase de ADN própria.  Dois tipos de inibição de polymerase de ADN de Taq foram tentados que incluem a inibição do oligonucleotide (21) e a inibição do anticorpo (22). Os inibidores altamente específicos do oligonucleotide de ambos os polymerases de ADN de Taq foram produzidos.  Estes inibem seletivamente a atividade do polymerase de ADN em temperaturas abaixo de 40°C e foram mostrados à função em aplicações de começo quente.  Alternativamente, um pode usar um anticorpo de encontro ao polymerase de ADN de Taq. O anticorpo inibe o polymerase de ADN até que a temperatura do PCR esteja tal que o anticorpo está desnaturado em uma temperatura maior do que 55°C, liberando desse modo a enzima.  De qualquer modo há umas desvantagens a este tipo de condições do começo quente.  Neste caso, um precisa um anticorpo para cada enzima diferente usada em um PCR e para um grande número PCRs este pode levantar-se custos significativamente.  O formulário o mais conveniente do começo quente é modificar o polymerase de ADN de tal maneira que é inativo na temperatura ambiente (mutante sensível à temperatura), e re-activated somente depois da incubação em 95°C por 6-15 minutos (23).
As vantagens principais do PCR como um método do clonagem incluem seus rapidez, sensibilidade, e vigor

Por causa de sua simplicidade, o PCR é uma técnica popular com uma escala de aplicações larga

incluindo arranjar em seqüência direto, clonagem genomic, ADN que datilografam, deteção de micro-organismos infecciosos, o mutagenesis local-dirigido, a pesquisa pré-natal da doença genética, e a análise das variações allelic da seqüência (1.7.13.16) que dependem de essencialmente três vantagens principais do método:

Velocidade e facilidade de utilização:   O clonagem do ADN pelo PCR pode ser executado em uma quantidade de tempo relativamente curta, dentro de algumas horas.  Geralmente, uma reação do PCR consiste em ao redor 30 ciclos cada ciclo que contem uma desnaturação, síntese e reannealing a etapa, com um ciclo individual que toma tipicamente o minuto3 5 em um cycler térmico automatizado.  Isto é claramente mais rápido do que o tempo exigido para o clonagem cell-based do ADN, que poderia tomar semanas do tempo.  Além disso, é completamente fácil setup uma reação do PCR e o uso de uma máquina do thermocycler é igualmente fácil.  Alguma hora é exigida para o projeto e a síntese de primeiras demão do oligonucleotide, mas esta foi simplificada pela disponibilidade do software de computador para o projeto da primeira demão e pela síntese comercial ou académico rápida de oligonucleotides feitos sob encomenda.   A optimização de condições do PCR pode ser exigida como a temperatura do recozimento da primeira demão, a concentração do magnésio, e a concentração da primeira demão.  Entretanto, a criação das máquinas do PCR do inclinação que permitem que uma variedade de temperaturas do recozimento da primeira demão sejam testadas ao mesmo tempo diminuiu extremamente o tempo exigido para esta etapa.  As condições óptimas para uma reação foram obtidas uma vez, a reação podem então simplesmente ser repetidas (1.7.13.16).

Sensibilidade:  O PCR é capaz de amplificar as seqüências das quantidades minuciosas de ADN do alvo, mesmo o ADN de uma única pilha (24).  Tal sensibilidade requintado teve recursos para métodos novos de estudar a patogénese molecular e encontrou aplicações numerosas na ciência judicial, no diagnóstico, na análise genética do enlace usando o único-esperma que datilografa e nos estudos moleculars da paleontologia, onde as amostras podem conter números minuciosos de pilhas. Entretanto, a sensibilidade extrema do método significa que grande tem que ser tomado para evitar a contaminação da amostra sob a investigação por external ADN, como de quantidades minuciosas de pilhas do operador (1.7.13.16).

Vigor:  Uma escala larga de fontes do ácido nucleico é moldes apropriados para a amplificação do PCR.  DNAs Purified da vária espécie e as fontes foram amplificados.  O PCR pode permitir a amplificação de seqüências específicas do material em que o ADN ruim é degradado ou encaixado em um media de que a isolação convencional do ADN é problemática. Em conseqüência, é outra vez muito apropriado para a antropologia molecular e a paleontologia estuda, por exemplo a análise do ADN recuperada de archaeological permanece. Foi usada igualmente com sucesso para amplificar o ADN de formalin-fixo ou as amostras de tecido parafina-encaixadas, que tem aplicações importantes na patologia molecular e, em alguns casos, no enlace genético estudam.  Geralmente, o sucesso da amplificação do PCR é o grande quando os fragmentos do alvo são relativamente abundantes (1.7.13.16).
Limitações do PCR

Apesar de sua popularidade enorme, o PCR tem determinadas limitações como um método para seletivamente clonar seqüências específicas do ADN.

A fim construir as primeiras demão específicas do oligonucleotide que permitem a amplificação seletiva de uma seqüência particular do ADN, alguma informação prévia da seqüência é geralmente necessária.  Isto significa normalmente que a região do ADN de interesse tem sido caracterizada em parte previamente, clonagem cell-based prévio frequentemente seguinte do ADN.  Entretanto, uma variedade de aproximações foram desenvolvidas que reduzem ou mesmo excluem a necessidade para a informação prévia da seqüência do ADN a respeito do ADN do alvo.  As seqüências previamente uncharacterized do ADN podem às vezes ser clonadas usando o PCR com oligonucleotides degenerate se são membros de um gene ou a família repetitiva pelo menos uma do ADN cujos de membros tem sido caracterizado previamente.   Em alguns casos, o PCR pode ser usado eficazmente sem nenhuma informação prévia da seqüência a respeito do ADN do alvo para permitir o indiscriminateamplification de seqüências do ADN de uma fonte de ADN que está atual em quantidades extemely limitadas.  Conseqüentemente, embora o PCR possa ser aplicado para assegurar a amplificação inteira do genoma, não tem a vantagem do clonagem cell-based do ADN em oferecer uma maneira de separar os clone individuais do ADN que compreendem uma biblioteca genomic do ADN.

A quantidade de produto do PCR obtida em uma única reação é igualmente muito mais limitada do que a quantidade que pode ser obtida usando o clonagem cell-based onde escale-acima dos volumes de culturas de pilha é possível. A eficiência de uma reação do PCR variará do molde ao molde e de acordo com os vários fatores que são exigidos para aperfeiçoar a reação mas tipicamente somente as pequenas quantidades de produto são conseguidas comparativamente.

Embora o rendimento teórico do PCR seja exponencial, o rendimento real de um PCR está indicando muito menos que o esquema se está operando com menos do que seu potencial máximo.  Por exemplo, a quantidade de produto em cada ciclo nivela eventualmente fora.  Este platô pode ser explicado pelos seguintes fenômenos.  Primeiramente, algum do molde pode nunca ser devido disponível encalhar rupturas ou falha do ADN ao separado de outras macromoléculas durante a purificação e os thermocycles iniciais.  Em segundo lugar, a quantidade de enzima é finita e eventualmente a atividade pode diminuir.  Thirdly, como a concentração do produto double-stranded alcanga altos níeses, a competição aumenta entre o recozimento do molde (produto do PCR) à primeira demão e reannealing das costas complementares do molde (1.7.13).

De muitas vezes grande uma desvantagem óbvia e do PCR como um método do clonagem do ADN foi a escala do tamanho das seqüências do ADN que podem ser clonadas.  Ao contrário do clonagem cell-based do ADN onde o tamanho de seqüências clonadas do ADN pode aproximar o Mb 2, relatado as seqüências do ADN clonadas pelo PCR estiveram tipicamente nas 0.1escalas de um tamanho de 5 kb, frequentemente na extremidade mais baixa desta escala.  Os fragmentos pequenos do ADN podem geralmente ser amplificados facilmente pelo PCR, porém se torna cada vez mais mais difícil obter a amplificação eficiente enquanto o comprimento desejado do produto aumenta.  Barnes (25) reconheceu uma limitação do comprimento do alvo à amplificação do PCR do ADN.  Usou uma combinação de um de nível elevado de um exonuclease-livre, mutante do apagamento do N-terminal do polymerase de ADN de Taq, Klentaq1, com um muito de baixo nível de um polymerase de ADN thermostable que exibe 3 profundos ‘ – uma atividade do exonuclease (Pfu, respiradouro, ou respiradouro) para conduzir o PCR longo da fidelidade elevada. Pelo menos o kb 35 do bacteriófago lambda pode ser amplificado aos rendimentos elevados de 1 ng do molde do ADN do lambda.  O uso deste método rendeu a fidelidade aumentada dos base-pares, a habilidade usar produtos do PCR como primeiras demão, e o rendimento máximo do fragmento do alvo.  Outras circunstâncias foram identificadas para a amplificação eficaz de uns alvos mais longos, incluindo a amplificação o kb até 22 do kb do conjunto do gene da beta-globina do ADN genomic humano e até 42 de ADN do lambda do phaga (26).  As condições para estes PCRs longo incluíram o pH aumentado, adição de glicerol e de sulfoxide dimethyl, diminuída tempos da desnaturação, aumentada tempos da extensão, e o uso de um polymerase de ADN thermostable secundário que possuísse ‘ – a 5 ‘ – um exonuclease 3, ou da “correcção,” atividade.  “O protocolo do PCR longo” manteve a especificidade exigida para alvos no ADN genomic usando níveis inferiores do polymerase e condições da temperatura e do sal para o recozimento específico da primeira demão.  A habilidade de amplificar seqüências do ADN do kb 10-40 trará a velocidade e a simplicidade do PCR ao traço genomic e a arranjar em seqüência e facilitará estudos nas genéticas moleculars (26).  Geralmente, as condições para o PCR da escala longa envolvem uma combinação de modificações às condições padrão com um sistema do dois-polymerase.  Isto fornece níveis óptimos de atividade do polymerase e do exonuclease a 3 ‘ 5 ‘ de ADN que sere como um mecanismo de correcção (16).
Instrumentos para o PCR

Thermocyclers que regulam automaticamente temperaturas para a ciclagem do PCR foi introduzido em 1986 (figura 6).  Além do que os avanços em reagentes do PCR, os instrumentos novos para a ciclagem térmica automatizada e para analisar produtos do PCR foram desenvolvidos.  Os cyclers térmicos novos aumentaram taxas de aquecimento, refrigerando, e transferência térmica às embarcações modificadas da reação.  As embarcações da reação acomodadas pelos cyclers térmicos da primeira geração (ou mesmo por banhos da água e por blocos do aquecimento) eram tubos plásticos padrão do microfuge.  A amplificação do PCR nos tubos capilares finos permitiu a ciclagem térmica rápida, e a síntese do ADN a 20s.  A velocidade das mudanças de temperatura conseguidas nestes sistemas permitiu a definição precisa de situações óptimas da temperatura para cada etapa individual no ciclo do PCR.   Os cyclers térmicos da geração nova igualmente acomodam mais amostras, têm uns perfis térmicos mais precisos, e são programáveis (13).
Síntese do Oligonucleotide

Uma de menos contribuições apreciadas para a aplicação difundida do PCR foi o desenvolvimento da química automatizada de confiança para a síntese do oligonucleotide.  Até recentemente, a construção de um único oligonucleotide era uma tarefa substancial que poderia somente ser executada por um químico orgânico hábil.  Agora é possível comprar um ou outro um sintetizador do oligonucleotide que possa ser operado por um técnico ou pelos oligonucleotides ele mesmo de uma fonte comercial ou académico.  As máquinas multiplex da síntese do oligonucleotide foram construídas com o alvo de reduzir o custo total da síntese (27.28).  Porque os oligonucleotides definem os produtos eventuais do PCR, há pouco dúvida que na ausência de sua fonte pronta, o PCR não apreciaria a aceitação larga que tem ganhado hoje (13).
Projeto da primeira demão

Os investigadores concordados cedo com aquele o projeto de primeiras demão do PCR eram difíceis e incertos.  Os programas informáticos foram planejados para levar em conta todos os critérios de projeto.   Um dos primeiros programas escritos para o projeto da primeira demão era Olga que empreg a execução da GEMA da pesquisa de Digitas (gerente do ambiente dos gráficos) no ST de Atari (29).  Olga foi serida especificamente à reacção em cadeia do polymerase (PCR) que permite uma análise simultânea de duas seqüências da primeira demão.  A vantagem de Olga era que forneceu em análises de um programa para repetições diretas, estruturas secundárias e dimerization da primeira demão assim como diversas ferramentas úteis do “revestimento” para os trabalhadores acoplados em sínteses da optimização e do oligonucleotide do PCR.   O programa Primer3 no instituto de Whitehead é agora provavelmente a ferramenta a mais de confiança e a mais versátil atualmente disponível (30).
PCR hoje

PCRs pode agora ser executado permitindo a amplificação de fragmentos do ADN até diversos kilobases do comprimento em mais de um milhão de vezes sua abundância inicial.  O procedimento é altamente automatable e exige apenas algumas horas de começar thermocyling à análise de produto.  Este não era o caso previamente, e as exigências práticas para executar um PCR foram simplificadas extremamente desde os primeiros manuscritos do método (13).  Hoje, a maioria dos engates iniciais ou as incapacidades do PCR foram elaborados (8).   Além disso, o PCR expandiu para incluir mais de 270.000 artigos (31).
O PCR será substituído nunca? – amplificação Helicase-dependente (TEVE)

A reacção em cadeia do Polymerase é o método o mais amplamente utilizado para in vitro a amplificação do ADN entretanto que exige a desnaturação térmica ou thermocycling para separar as duas costas do ADN.  In vivo, o ADN replicated por polymerases de ADN com várias proteínas acessórias.   O helicase do ADN, proteínas acessórias de um polymerase de ADN actua para separar o ADN frente e verso dentro das pilhas.  Vincent e outros (32) planejou in vitro um método isothermal novo da amplificação do ADN imitandoin vivo o mecanismo da réplica.  a amplificação Helicase-dependente (TEVE) utiliza um helicase do ADN para gerar moldes single-stranded para a hibridação da primeira demão.  A extensão subseqüente da primeira demão é catalisada então por um polymerase de ADN.  TEVE não exige um thermocycler caro e assim o PCR pode ser executado praticamente em qualquer lugar.  Além, oferece diversas vantagens sobre outros métodos isothermal da amplificação do ADN tendo um esquema simples da reação e sendo uma reação isothermal verdadeira que possa ser executada em uma temperatura para o todo o processo. TEVE a grande promessa das ofertas no desenvolvimento de dispositivos diagnósticos do ADN do portable simples de ser usado no campo e no ponto–cuidado (32).
Conclusões

Diz-se que a maneira a mais simples e a mais conveniente de definir o PCR é como umatécnica.  Entretanto, tal categorização elimina a história do desenvolvimento do PCR tantos como indivíduos sobre os anos contribuídos às idéias atrás da teoria do PCR e do fine-tuning da técnica.  A resposta a mais simples seguinte é nomear um indivíduo como o inventor da reacção em cadeia do polymerase.  Karry Mullis foi concedido o prêmio de Nobel para a química em 1993 para sua descoberta do PCR.  Entretanto, esta descoberta é contestada entre muitos cientistas, que podem ter contribuído a destravar este enigma.

Igualmente disse-se que o PCR não existiu até que estêve feito para trabalhar em um sistema experimental.  Com o isto na mente, meramente o pensamento de um conceito não é suficiente; um conceito deve com sucesso ter sido põr na prática (33).

Embora haja uma dúvida a respeito do criador final do PCR, e uma dúvida a respeito da possibilidade que PCR pode de algum modo ou algum dia ser substituído, há pouco dúvida o impacto que o PCR criou sobre uma extensão do curto período de tempo no estudo da biologia molecular e da vida.

Referências

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